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技術導航 ▎建設PCR實驗室勢在必行!

   日期:2020-04-30     來源:現代實驗室裝備網    瀏覽:1083    
核心提示:臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。
 

小代君說

一、

概述

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗,是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法,測出一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。更能夠檢測出最近的新型冠狀病毒性肺炎是否在人體內。


由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒,并具有靈敏性高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優點,因此被臨床醫生廣為認可,已廣泛應用于醫院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是,這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗室和非常規范的操作為前提。


▲PCR擴增圖解

近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設越來越得到重視,因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。


本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的平面布局,空調通風系統設計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實驗室設計中的主要特點進行了闡述。

 

臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。因此,實驗室的平面布局、空調通風系統設計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下面就對這幾個方面分別進行說明。

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二、

PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢測實驗室原則上分為四個單獨的工作區域:試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配置和擴增區、擴增產物分析區。為避免交叉污染,進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行,即只能從試劑貯存和準備區—標本制備區—擴增反應混合物配置和擴增區—擴增產物分析區。


▲各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

三、

實驗室空調通風系統設計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求,但是為了避免各個實驗區域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時,要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區的壓力要求。

1.試劑貯存和準備區

該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區,不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制,本區并沒有嚴格的要求。

2.標本制備區

該區域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、儲存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

 

本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為正壓,以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外,由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染,所以應避免在本區內不必要的走動。

3.擴增反應混合物配制和擴增區

該區域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外,已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中,通常在第一輪擴增后必須打開反應管,因此巢式擴增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區內進行。

 

本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免氣溶膠在本區漏出,為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內的不必要走動。個別操作如加樣等應在超凈工作臺內進行。

4.擴增產物分析區

該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測,此區域可不設。

 

本區是最主要的擴增產物污染來源,因此對本區的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。



 

四、

污染的預防和控制

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中,常見的有以下幾種污染類型:擴增產物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發生污染,實驗就必須停止,直到找到污染源為止,而且實驗結果必須作廢,需重新進行實驗。所以發生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣,浪費人力物力。因此要避免污染,首先應是預防,而不是排除。

1.工作區域的嚴格劃分

(1)各個實驗區域設置合理;

(2)各個實驗區域要有明顯的標記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等),以避免各個不同實驗區域設備物品、試劑等發生混淆。

2.合理的系統設置

(1)合理的空調通風系統設置,盡量采用全送全排的空調系統;

(2)嚴格的氣流壓力控制,保證不同的實驗區內不同的壓力要求。

3.規范的操作

(1)臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓,經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗工作;

(2)在實驗操作過程中,操作者必須戴手套,并經常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施;

(3)清潔工作及時、正確。實驗工作結束后,必須立即對本區進行清潔。除常規的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈照射消毒外,對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。

4.嚴格的管理

(1)嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室,有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區的門;

(2)在各個實驗區域使用帶有明顯區別標志的工作服(如不同顏色),當工作人員離開時不得將本區的工作服帶至其他區域;

(3)盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性;

(4)擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源,廢液不能在實驗室中傾倒,必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉,用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理,如焚燒等;

(5)擴增產物分析區可能會用到某些可致基因突變和有毒物質,應特別注意實驗人員的安全防護。

5.完備的實驗室配套設施

完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件,應根據各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器,如超凈工作臺、離心機、加樣器等。

 

 
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